干细胞的衰老是人体衰老的根源

衰老是自然界的常见现象，伴随着生命周期中遗传损伤的累积，以及DNA损伤和修复之间失衡导致的基因突变。在这个衰老过程中，身体中的每个细胞和器官都会出现一定程度的功能衰退或恶化。例如，随着年龄的增长，皮肤失去弹性，伤口愈合的速度比童年时要慢，骨折时需要更长的时间才能愈合。简而言之，受损组织或器官的再生能力降低是衰老的最显著特征。

简要概论

机体衰老过程中出现九个特征：基因组不稳定性、端粒消耗、表观遗传改变、蛋白质稳态的丢失、营养吸收能力下降、线粒体异常、细胞衰老、干细胞耗竭、细胞通讯的改变^[1]。

衰老是细胞对内源性和外源性压力的反应，并限制了受损和衰老细胞的修复和更新^{[2, 3]}。DNA损伤、端粒缩短、致癌损伤、代谢应激、染色质重塑、表观遗传学改变和线粒体功能障碍等有害刺激均可诱导其发生。衰老是一个动态的过程，渐进的，多步骤的，最终不可逆^[4]。干细胞老化有几个因素：端粒缩短、INK4a/ARF基因位点和细胞周期调节因子的下调、DNA损伤的积累、表观遗传学、线粒体结构的变化、信号通路以及全身性因素^[5]。

在许多人类组织中，随着年龄的增长，细胞分裂能力的下降似乎与端粒随着细胞分裂而逐渐变短有关。端粒功能障碍通过激活细胞固有的检查点和诱导干细胞的微观和宏观环境的改变来损害干细胞的功能^[6]。端粒的维持是基因组完整性的关键因素之一，端粒功能失调或功能缺陷会导致增殖组织再生障碍并加速衰老^[7]。

组蛋白乙酰化控制染色质结构，从而影响基因表达的调节。具有组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)活性的酶也在衰老过程中起作用，其中最重要的是SIRT1和SIRT2，它们的表达已被证明是年龄相关的^[8]。SIRT1在MSC生长和分化中的作用随着年龄的增长而减弱^{[9, 10]}。

线粒体DNA（mtDNA）突变的积累与衰老之间存在重要联系^{[11, 12]}。在衰老过程中发生线粒体DNA突变的积累，会导致呼吸链功能障碍。值得注意的是几个信号通路，如腺嘌呤激活蛋白激酶（AMPK）通路和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT通路，以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1（PGC-1，是线粒体能量代谢的关键调节因子）^[13]。

成体干细胞，存在于身体的不同组织中，为器官提供生长和再生的能力，以在其有生之年维持体内平衡。活着的有机体的再生能力取决于其干细胞取代受损组织或破损细胞的能力和潜力，故而干细胞的衰老，导致了机体整体的衰老。所有的衰老现象--组织退化--都可以被解释为机体干细胞水平上的衰老迹象^[14]。 

成体干细胞的衰老

（一）造血干细胞（HSC）的衰老改变

俄国科学家Alexander A.Maximow在1908年柏林的一次血液病大会上的提出干细胞的概念，并于1909年正式发表阐述干细胞内涵的文章。但现代干细胞研究始于1963年，Lou Siminovitch团队建立了检测造血干细胞的方法，并在小鼠的骨髓中发现了造血干细胞（HSC）^[15]。

1，免疫衰老

骨髓中的造血干细胞分化产生整个免疫系统的免疫细胞。适应性免疫系统无法产生保护性免疫，伴随着免疫系统的保真度（fidelity）和效能（efficiency）下降，被称为免疫衰老。免疫衰老的一个主要特征是炎症和抗炎网络之间的失衡，伴随着持续的低度炎症和对自身免疫反应的更大易感性^{[16, 17]}。

免疫系统的衰老，根源在于HSC的老化。造血系统的老化表现为适应性免疫系统和先天免疫系统的功能衰退，这种免疫细胞的衰老导致对病原微生物的高度易感性、疫苗接种的低效，以及对自身免疫和血液系统恶性肿瘤发展的易感性增加^[18]。通过T细胞和B细胞共缺陷小鼠移植HSC的实验，证明机体衰老时免疫系统的表型和功能变化主要是HSC在衰老过程中功能变化的结果，并且在很大程度上独立于胸腺的功能^[19]。

衰老细胞产生促炎介质和蛋白酶，这被统称为衰老相关分泌表型（SASP）。SASP因子招募免疫细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞和T细胞，并促进炎症^[20]。SASP诱导的免疫细胞募集是一个基本的生理过程，它消除了不需要的细胞，并导致了发育和生理上必要的组织重建^[21]。然而，如果这些促炎信号和炎症过程没有得到适当的调控，它们可能会促进病理性炎症，比如衰老的平滑肌细胞促进血管炎症^[22]和内皮细胞和平滑肌细胞的细胞衰老也可能导致动脉粥样硬化中的炎症无法消退^[23]。巨噬细胞对清除衰老细胞也是必不可少的。与年龄相关的微环境变化会改变组织内的巨噬细胞功能，表现出与年龄相关的吞噬能力和抗原提呈能力降低^[24]。

2，造血干细胞的衰老

大多数造血干细胞（HSC）在动态平衡状态下是静止的，很少进行周期自我更新或分化为子代的细胞^{[25, 26]}。造血受到内在和外在机制的严格调控，这两种机制平衡了静止、自我更新和分化，以维持正常的多谱系细胞的稳定和系统重建^{[27, 28]}。

随着每一次细胞分裂，HSC分化为血细胞的潜能下降，同时，潜能降低的子代造血祖细胞数量增加，以弥补单个干细胞功能的丧失^[29]。因此，造血干细胞自身的大量增殖，会导致造血干细胞的耗竭；而静息状态有利于维持造血干细胞的功能和年轻态干性。在多种慢性和生理相关的应激状态下，DNA结合蛋白的抑制子1（Id1）的缺失可以保护HSC免于耗尽，并促进它们的静止，因而靶向Id1可能会改善HSC在慢性应激和衰老过程中的存活和功能^[30]。

随着年龄的增加，髓性HSC群体的扩大，在整个老年HSC池中占据主导地位。HSC的衰老，主要表现在这几方面：（1）B细胞的产量随着年龄的增长而显著减少，B细胞谱系的多样性也随着抗体亲和力降低和类别转换受损而降低；（2）新生T细胞的产生也随着年龄的增长而下降，部分原因是胸腺退化；（3）NK细胞显示细胞毒作用和细胞因子分泌减少；（4）虽然髓系细胞数量增加，但其功能降低，例如，中性粒细胞对刺激的迁移减少，巨噬细胞的吞噬活性降低；（5）后期红细胞生成也减少^[31]。

事实上，年轻的骨髓细胞在移植到老年受者体内时，植入效果比移植到年轻受者身上是要差不少的^{[32, 33]}。尽管在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗下释放到循环中的老年和年轻HSC具有相似的动员效果，但将老年HSC静脉移植到接受照射的受者体内时，老年HSC的骨髓归巢效率显著降低^{[34, 35]}，因此不建议老年人捐骨髓。在移植实验中，年轻的HSC在造血功能上都优于年老的造血干细胞^{[32, 36, 37]}。

HSC老化最不可逆的原因与随机DNA损伤的积累有关。DNA修复相关蛋白质编码基因突变的小鼠或患者常常表现出HSC过早老化的特征^[38-40]。老化的HSC积累了更多的DNA损伤，可能是因为细胞内活性氧（ROS）水平较高，并自然产生了遗传毒性代谢产物^{[39, 41, 42]}。老年HSC还因为长期积累的增殖压力导致DNA复制效率低下和转录抑制^[43]。衰老被认为主要是由p16的激活引起的，事实上，p16的表达是衰老细胞存在的一个标志^[44]。但是也有研究显示p16介导的衰老增加对体内稳态HSC老化的影响很小^[45]。

由线粒体产生的高水平ROS在衰老的造血干细胞中不断积累，并最终损害造血干细胞的功能^{[41, 46]}。线粒体自噬，能清除过多的ROS，从而减少氧自由基对线粒体的损伤。很大一部分衰老的造血干细胞表现出自噬水平受损，而一定程度的自噬流能维持造血干细胞的年轻态^[47]。

间充质干细胞（MSC）和内皮细胞是血管周围的HSC巢（生态位，Niche）的主要细胞成分，对HSC的增殖分化功能和衰老有重要的影响^{[28, 48]}。在衰老过程中，骨髓微环境会发生许多细胞和结构的变化，这些迄今知之甚少的细胞外在基质的变化可能会从本质上影响干细胞的功能^[31]。

如上所述，随着年龄的增长，造血干细胞的衰老，导致免疫系统出现衰老，表现在体内免疫细胞吞噬功能下降，细胞迁移改变，产生特异性抗体的能力下降等变化；临床上，这些变化可能通过增加感染、恶性肿瘤和自身免疫率而增加老年人的发病率和死亡率^[49]。由于炎症和衰老都可能增加白血病发生的风险，消除不需要的炎症衰老因子是保存HSC和免疫功能的潜在途径，从而防止造血功能下降和恶性克隆的出现^[31]。

（二）间充质干细胞（MSC）的衰老改变

1，年老MSC和年轻MSC的功能比较

人和小鼠一旦出生后，骨髓里面的MSC的含量持续下降，虽然身体机能在青春期达到巅峰，但是对于骨髓MSC来说，MSC出道面世即是颠峰！

和年轻供体的MSC相比，年纪大的供体来源的MSC增殖能力明显下降^[50-54]，老龄MSC的胞体因为衰老而增大^{[51, 55-57]}。而且年纪大的供体来源的表达SA-β-gal阳性MSC数量增多^[58]。MSC的抗氧化能力也随着年纪增大而逐渐下降^[59]。年龄相关衰老的骨髓MSC多种膜蛋白也表达下降：CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146和CD166^{[60, 61]}。有意思的是，MSC的成脂/成骨/成软骨分化是MSC的一个基础特性，并不受年龄的影响^[62]。成骨分化的效率和MSC的多项分化能力没有必然的关联性^[62-65]。

从多个供体来源的骨髓MSC在克隆形成、细胞大小、增殖潜能和免疫抑制方面均有个体化差异^[66]。根据克隆性CFU-F实验，骨髓MSC的数量随着年龄的增大而下降^[67-69]，导致不能有效地促进组织祖细胞的更新^[70-74]。成年骨髓MSC数量减少，衰老标志物(ROS、p21、p53)增加^[73]。MSC存在明显的与年龄有关的细胞增殖的差异，老年MSC或衰老的MSC表现三个方面的下降：细胞质量、分化能力和迁移能力^[75-78]。与年轻供者分离的细胞相比，老年的MSC还表现出衰老的其他特征，比如活力、增殖和分化能力的降低^{[73, 78, 79]}。因此，有研究发现老年MSC的临床治疗效果欠佳^{[51, 54, 73]}。

肥胖者脂肪组织来源的MSC由于氧化和代谢应激的增加，这种应激影响脂肪MSC线粒体，导致DNA损伤、端粒缩短、增殖和干性减少（表现为NANOG、SOX2和OCT4的表达减少），增加凋亡和衰老^[80]。有趣的是，从皮下或内脏脂肪等不同解剖部位分离的脂肪MSC的功能特性出现不同程度的差异^[81]。肥胖环境还导致特定的DNA甲基化，导致线粒体形状和数量的变化，从而影响脂肪MSC细胞的功能特性，涉及脂肪生成、炎症和免疫抑制^[82]。与年轻的MSC共培养的巨噬细胞表达M2表型的标记Arg1和IL-10，而与衰老的骨髓MSC共培养的巨噬细胞表达M1相关的TNF-α^[83]。此外，年龄依赖性的脂肪生成增加，可能通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPAR-γ2）和CCAAT/增强子结合蛋白（CCAAT/EBP）而导致SASP状态^[84]。

来自不同年龄捐赠者的BM-MSC的EV在其含量和免疫特征方面显示出显著的年龄差异^[85]。在小鼠模型中，来自年轻MSC的胞外囊泡（EV）含有更高水平的自噬相关mRNA和sirtuins，能使得衰老的造血干细胞（HSC）显示出恢复的功能和活力^[86]。相反，来自老年捐赠者的骨髓MSC释放SASP，促进了HSC的炎症状态而导致年轻HSC的功能损害^[87]。

根据多组学分析，S100A6、S100A11和HSPs等几种分子介导的损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Pattern，DAMP）反应在老年MSC中显著增加^[88]。此外，免疫抑制性miRNA的减少可能是发生DAMP反应的关键因素^[89]。

2，MSC的年龄性衰老（老化）

MSC经过一定数量的细胞分裂后进入衰老，其形态学特征是细胞形态变大、不规则，最终停止增殖，而不适当的培养条件明显加速了这一过程。老化的MSC降低了多项分化潜能和组织修复所需的生长因子的产生^[90-92]。衰老和氧化应激可显著增加骨髓细胞外小泡的miR-183-5p载量，导致细胞增殖减少、成骨分化减少，并通过降低血红素加氧酶-1（Hmox1）活性介导MSC衰老^[93]。

衰老的MSC表现出克隆生成和增殖能力降低，分化潜能偏向脂肪生成而减弱了成骨生成^{[94, 95]}。在体内，MSC衰老意味着成骨能力降低，从而导致与年龄相关的疾病，如骨质疏松症^[96]。因此，MSC老化被认为是骨折愈合随年龄增长而受损的原因^[97]。这也部分解释了为何老年人容易出现骨质酥松症，也解释了为何老年骨髓中的脂肪细胞增多。

MSC的年龄相关性细胞衰老有关，表现为增大、端粒缩短或p53/p21介导的DNA损伤堆积，DNA甲基化或组蛋白乙酰化受损，ROS和一氧化氮(NO)水平升高^[98-100]。DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂5-氮杂胞苷（5-AZA）逆转了MSC的衰老表型，细胞增殖率增加，氧化应激产物积聚减少，DNA甲基化状态降低^[101]。DNMT的抑制导致了活性状态的组蛋白标记的改变，并诱导了p16和p21启动子区域的CpG岛去甲基化，上调p16和p21的表达^[102]。所有这些数据表明，DNMTs和HDACs在调节MSC衰老中起着关键作用^[103]。

氧化还原控制在MSC衰老过程中起着核心作用。在稳定状态下，MSC普遍进行糖酵解，并具有较低的ROS水平^[104]。然而，随着渐进式复制，ROS的显著产生，导致MSC细胞大分子的损伤，参与了几个细胞通路，包括p53、FOXO1、2Nrf2、microRNAs（miRNAs）和长非编码RNAs（LncRNAs）^[105]。

因此，特定的CpG甲基化模式可以代表一个生物标记物来估计年代年龄，从而起到“表观遗传时钟”的作用^[106]。以类似的方式，在细胞体外复制衰老过程中会发生可调节且可重现的DNA甲基化变化，并可用于监测细胞制剂的衰老^[107-109]。DNA碱基的另一种表观遗传修饰以5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)为代表，它是最近被提出的与年龄相关的额外表观遗传生物标记物，与5-甲基胞嘧啶(5mC)丢失有关^[110]。

有研究表明，自噬是维持干细胞的干性和分化能力所必需的，而自噬在干细胞老化过程中会受到损害^[111]。随着年龄的增长，骨髓MSC和骨细胞的自噬功能减弱；自噬的激活可以缓解骨髓MSC的衰老，恢复衰老的骨髓MSC的成骨分化和增殖^[112]。自噬可以保护MSC免受过度的氧化应激^[113]，但是，抑制自噬能减轻MSC长期培养过程中的衰老状态^[114]。越来越多的证据表明，从MSC释放的外泌体有能力挽救损伤细胞的自噬功能^[115]。

培养液中的高糖诱导了骨髓MSC的自噬，增加Beclin-1、Atg5、Atg7和Atg12的表达，增加LC3-Ⅱ的生成和自噬小体的形成，同时伴随着细胞衰老的发生有关，这表明高血糖可以通过氧化剂介导的自噬诱导MSC衰老，从而导致骨髓生态位功能障碍；N-乙酰半胱氨酸（NAC）和NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘（DPI）能有效地消除高糖诱导的自噬并延缓衰老^[116]。关于自噬和衰老之间关系的现有数据部分是矛盾的：实际上，自噬可能会促进衰老，也可能会抑制衰老，这取决于细胞环境和压力的种类^[117]。

3，衰老相关分泌表型（SASP）

SASP是一种将细胞衰老与组织功能障碍联系起来的新机制。衰老细胞产生所谓的SASP分泌体，SASP通过自分泌/旁分泌调节环路来维持和放大衰老，涉及SASP产生细胞和周围细胞，即SASP负责将衰老传递到相邻细胞，从而引发致命的退行性疾病^{[118, 119]}，并导致持续的低水平慢性炎症（定义为炎性衰老）^[120]。SASP呈现出一种动态的成分，包括促炎症细胞因子（如IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-8）、趋化因子、生长因子和蛋白酶（如MMP-1、MMP-3和MMP-10），它们的组合取决于细胞类型、微环境和衰老诱导机制^[2]。

衰老的骨髓MSC出现SASP状态，过度释放SASP相关的外泌体，包括IL-6、IL-8、IFN-γ、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和基质金属蛋白酶（MMP-2、TIMP-2）；由这些分泌分子引起的全身性炎症反应降低了MSC的免疫调节功能，促进了癌症进展^[121]。体内骨髓衰老的MSC成脂分化增强，而成骨分化减弱^{[122, 123]}，同时分泌外泌体（miRNA-146a）和SASP，刺激巨噬细胞的极化从M2型向M1型转变，从而加剧了炎性衰老^[124]。

利用LC-MS/MS蛋白质组鉴定和随后的基因组分析（GO）将SASP将SASP成分分为四类：细胞外基质/细胞骨架/细胞连接、代谢过程、氧化-氧化还原因子、以及基因表达的调节；并鉴定出三个关键信号通路：MMP2-TIMP2、IGFBP3-PAI-1、Peroxiredoxin 6-ERP46-PARK7-Cathepsin D-Major vault protein^[125]。

（三）衰老与炎症：炎性衰老（inflammaging）

组织和细胞在活体细胞周转和新陈代谢过程中产生的所有类型的物质，包括细胞碎片、代谢物、不完全降解或非酶处理的产物，被称为“分子垃圾”^[126]。为了处理分子垃圾和维持体内的动态平衡，已经开发出几种适应性策略，如识别PAMP或MAMP（微生物相关分子模式），它们可以直接激活模式识别受体（PRRs）和下游的炎症级联反应。动物中存在被称为“自噬/有丝分裂吞噬”的救援机制，也是为了避免体内细胞排泄物堆积不足，但是其功能在炎症环境中变得有缺陷，包括泛素蛋白酶体系统的失调和DNA损伤反应的激活等^[127]。

炎症是抵御有害物质入侵危及生命的一种防御机制，在儿童和成人时期维持内环境稳定，但慢性炎症是心血管疾病、糖尿病、癌症和阿尔茨海默病等年龄相关疾病的共同病理基础，并可能是增加老年人大多数退行性疾病的发病率和死亡率的重要危险因素^[128]。组织微环境的变化，如细胞碎片的积累，代谢和激素信号的系统性变化，也可能导致慢性炎症的发展。单核/巨噬细胞系细胞对这些与年龄相关的变化至关重要，这些变化最终导致慢性炎症性疾病的发展^[129]。

大多数与衰老相关的疾病都是由共同的和相互依存的条件导致的，这些条件包括：慢性低度炎症、大分子/细胞器功能障碍、干细胞功能障碍和衰老细胞堆积^[130]。在动物模型中遗传和药物消除衰老细胞可以延长寿命并延缓与年龄相关的病理的发生^[131]。细胞水平上的衰老可能是炎症的原因。随着年龄的增长，组织中积累的衰老细胞分泌促炎细胞因子，即为“衰老相关分泌表型”（SASP），有助于炎症的发生^[132]。因此，长期以来，炎症一直被认为是许多组织癌症发展的驱动力^[133]。所以，消炎很重要！

小结

长寿是人类的终极目标，而长寿意味着要对抗衰老。有文章指出，目前有9种抗衰老（延缓衰老）的干预手段，即干细胞疗法、消炎药和血清年轻因子、减少损伤的细胞、增强端粒酶活性、表观遗传药物、激活机体监视和蛋白降解系统、饮食限制、线粒体自噬、清楚衰老的细胞^[1]。

MSC在体内的老化被认为是组织和器官功能随机体老化而下降的部分原因。与青年小鼠相比，老化的环境可以抑制成体干细胞的功能和潜力^[134-137]。包被在细胞培养表面的透明质酸多糖能够保持人MSC的分化潜能，提高增殖能力，刺激端粒酶活性，延缓衰老^[138]。因此，人体的透明质酸含量丰富，可以初步反映出体内MSC的衰老程度。人体进入中年后，尤其是皮下的透明质酸含量下降，不仅出现皮肤皱纹，也提示体内的MSC逐渐衰老。

值得庆幸的是，输入健康的MSC可以延缓机体的衰老。MSC可能会感受到从受损的体细胞释放的线粒体，并随后做出相对于的应答，启动MSC自身对损伤细胞的适应性修复反应^[139]。健康的MSC细胞碎片可以被机体的免疫细胞所摄取，促进体内的巨噬细胞的极化从M1型向M2型转变^[140]。输入的MSC在体内凋亡后产生的凋亡小体刺激体内内源性MSC的增殖更新，使得骨髓中的MSC恢复到年轻态^[141]。MSC老化的关键调节因子仍未完全确定，可以作为对抗年龄相关疾病和机体衰老的治疗靶点。

有意思的是，更年期和卵巢切除会导致轻度全身炎症状态，血浆趋化因子水平升高，而雌激素治疗会抑制这种状态^[142]。因此，对于女性来说，拥有健康而且有良好功能的卵巢，是一件很重要的事。MSC同样能维护卵巢的功能，甚至能治疗卵巢早衰导致的不孕。

参考文献：略